Enterococcus spp в моче

О патогенности энтерококков впервые упоминается в конце XIX в.: MacCallum и Hastings выделили этот микроорганизм из биоматериала больного острым эндокардитом и дали название Micrococcus zymogenes на основании его ферментативных свойств. Микроорганизм был устойчив к нагреванию до 60 °С, а также к различным антисептикам, включая карболовую кислоту и хлороформ. Также было установлено, что при внутрибрюшинном введении белым мышам этот микроб вызывал летальный исход, в экспериментальных условиях Micrococcus zymogenes был причиной эндокардита.

Спустя столетие энтерококки приобрели существенное значение и заняли 2-е место после Е. coli, составив более 12% всех возбудителей нозокомиальных инфекций (НКИ). В последние го/ты, по данным зарубежных авторов, энтерококки как причина НКИ в клиниках интенсивной терапии занимают 3-е место. Энтерококки по антигенному строению (группоспецифическая тейхоевая кислота) отнесены R. Lancefield в начале 1930-х годов к стрептококкам группы D. Четкие отличия энтерококков от стрептококков по ряду признаков указывают на необходимость выделить энтерококки в самостоятельный род.

Это было подтверждено в 1984 г. в сравнительных исследованиях по гибридизации нуклеиновых кислот, а также анализом иммунотипировапия белкового комплекса энтерококков, в котором не обнаружено родства со стрептококками других серологических групп.

В настоящее время Enterococcus spp. разделяют на пять групп:
Группа I — Е. avium, E. gilvus E. malodoralus, Е. pollens, E.pseudoaxnum, Е. raffinosus, E.saccharolyticus.
Группа II — E.faecalis, E.faecium, Lactococcus spp., E. casseliflavus, E.galUnarum, E. mandtii.
Группа III — E. dispar, E. durans, E. hirae, E. porcinus, E. ratli.
Группа IV — E. asini, E. cecorum, E. sulfureus. Группа V E. columbae, Vagococcus spp.

Энтерококки окрашиваются по Граму положительно, представляют собой кокки, факультативные анаэробы. Enterococcus spp. это часть нормальной микрофлоры слизистых оболочек ЖКТ и половых путей женщин. Некоторые особенности этого микроорганизма обеспечивают ему длительное выживание в условиях окружающей среды. Энтерококки способны активно приспосабливаться к различным неблагоприятным факторам, передаваться в условиях стационара от человека к человеку через руки, инструменты. В литературе описаны случаи, когда источником НКИ оказались мобильные телефоны, стетоскопы, термометры и прочие объекты нозокомиальной среды.

Enterococcus spp. сохраняют жизнеспособность в течение не менее педели на различных поверхностях окружающей среды: на продуктах (например, па сыре — 180 дней), в почве — до 77 дней, на загрязненной одежде до 90 дней; при температуре -70 °С чистая культура энтерококка выживает в течение нескольких лет, на поверхности агара при +4°С — нескольких месяцев. Энтерококки утрачивают жизнеспособность при автоклавировании при температуре 121 С через 15 мин, при обработке сухим жаром при 160 -170 °С — через час. Эффективные дезинфектанты — 1% гипохлорит, формальдегид, 70% этиловый спирт, 2% глутаральдегид, препараты йода.

Энтерококки способны вызывать у человека гнойно-воспалительные процессы различной локализации, которые протекают обычно вяло, хронически. Инфекции человека в основном обусловлены двумя видами энтерококков: E.faecalis (80-90%) и E.faecium (5-15%). Другие виды выделяют из различных патологических биоматериалов значительно реже. В основном сообщения об инфекционных осложнениях энтерококковой природы касаются следующих видов: Е. durans, E. avium, casseliflavus, E. gallinarum, Е. raffinosus и Е. hirae. Основным местом обитания Е. faecalis служит кишечник человека, E.faecium — кишечник свиней. Распространенность энтерококков в окружающей среде объясняется также их природной устойчивостью к различным классам антимикробных препаратов, включая амипогдикозиды, b-лактамы и хинолоны.

Например, резистентность энтерококков к аминогликозидам есть следствие их способности блокировать проникновение препаратов через клеточную стенку. Впрочем, применение аминогликозидов возможно, но в комбинации с препаратами, способными проникать через клеточную стенку микроорганизмов. Следует заметить, что в настоящее время отмечается быстрое распространение штаммов энтерококков с высоким уровнем устойчивости к аминогликозпдам (> 1000 мкг/мл для стрептомицина и >500 мкг/мл для гентамицина), по пока это явление не до конца изучено.

Колонизация слизистых оболочек основное условие развития энтерококковой инфекции. Энтерококки, как уже отмечалось, колонизируют слизистую оболочку ЖКТ у здоровых людей, входя в состав микрофлоры фекалий (103—108 колониеобразующих единиц [КОЕ] в 1 г). Между энтерококками и эпителиальными клетками организма хозяина существует тесная связь, которая препятствует выведению их вследствие естественной подвижности кишечника. Большинство известных микроорганизмов растет в узком диапазоне значений pH, близких к нейтральному. Энтерококки должны преодолеть кислую среду желудка, чтобы попасть в нижние отделы кишечника, что возможно благодаря устойчивости этих микробов к низким значениям pH среды их обитания (pH 3,2-4,8 в течение 15-30 мин).

Прикрепленные бактерии гораздо легче, чем свободноплавающие, образуют кооперативные структуры с другими бактериями. Это особенно важно для развития синтрофной кооперации (вариант кооперации, при которой оба партнера полностью зависят друг от друга в своей жизнедеятельности). В прикрепленных бактериальных сообществах имеются более существенные возможности обмена плазмидами или эписомами. Плазмиды — это специальные внехромосомные генетические элементы, ответственные за внехромосомную передачу резистентности к одному или нескольким антимикробным препаратам. Энтерококки способны прикрепляться к эпителиальным клеткам различных отделов тонкой и толстой кишки, а затем проникать из просвета тонкой кишки через мезентериальные лимфоузлы в печень, селезенку.

Лечение антимикробными препаратами предрасполагает к развитию энтерококковых инфекций. Антибиотик-индуцированный усиленный рост Е. faecalis при соответствующих условиях (например, мукозит, энтеропатия) может привести к проникновению микроорганизма в кровь, что часто проявляется лихорадкой неясной этиологии. Механизм этот до конца не изучен.

Первый активный защитный барьер хозяина представляют различные типы клеток и гуморальных факторов иммунной системы, которые атакуют проникающие микроорганизмы. Фагоциты поглощают и лизируют патогенные микроорганизмы, очищая организм от них. Фагоцитированные микробные клетки оказываются внутри вакуоли (фагосомы), которая сливается с лизосомами и образует фаголизосому, внутри которой микробы подвергаются воздействию бактерицидных механизмов, зависящих и не зависящих от кислорода. В фаголизосоме образуются токсичные формы кислорода (супероксид-анион, пероксид водорода, синглетный кислород и гидроксил-радикал), которые вместе с другими антимикробными соединениями и оксидами азота вызывают гибель микроорганизмов.

Некоторые микробы способны избегать действия бактерицидных механизмов. Одно из предположений состоит в том, что фагоцитированные, но не лизированные тканевыми макрофагами энтерококки проникают через стенку кишки в лимфатическую систему, что приводит к системному распространению этого возбудителя.

E. faecalis отличаемся от Е. faecium мощной продукцией супероксид-аниона. Установлено, что основная часть штаммов Е. faecalis образует супероксид-анион, тогда как среди рода E. faecium такие штаммы встречаются менее часто. Покапано, что штаммы Е. faecalis, выделенные из крови больных, вырабатывают супероксид-анион на 60% больше, чем штаммы, выделенные из фекалий. Пока остается неясным, какую роль играет способность вырабатывать супероксид-анион в патогенезе энтерококковых инфекций. Возможно, штаммы энтерококков, отличающиеся мощной продукцией супероксид-аниона, способны лучше использовать среду своего обитания, лучше физиологически адаптированы к утилизации ограниченных ресурсов кишечника в условиях огромной конкуренции, что ведет к усилению их роста.

Готовность колонизировать слизистые оболочки хозяина, уже заселенные другими микробными сообществами, считают одной из загадок нозокомиальных энтерококковых инфекций. В связи с этим можно считать вполне обоснованным мнение, что активное применение цефалоспоринов III поколения — важный фактор риска колонизации и развития, энтерококковой инфекции в условиях стационара. Эти инфекции часто обусловлены полирезистентными штаммами энтерококков экзогенного происхождения, которые вынуждены конкурировать с эндогенными энтерококками за места обитания в организме хозяина. Показано, что госпитальные штаммы могут вырабатывать поверхностный белок новой структуры, который был обнаружен у 40% штаммов при эндокардитах, у 29% штаммов при бактериемии и у 3% штаммов, выделенных из фекалий. Функция этого белка в биологии Е. faecalis пока неизвестна, по не исключено его значение для колонизации экзогенных штаммов энтерококков.

В 10-20% случаев энтерококки выделяются из биоматериалов, исследуемых по поводу интраабдоминальных абсцессов, причем считается, что энтерококки способствуют развитию абсцессов, как правило, только в сочетании с анаэробными микроорганизмами (например, Fusobacierium varium, Bacteroides fragilis). Такая особенность обязательно должна учитываться при выборе антимикробной терапии интраабдоминальных абсцессов.
Энтерококки составляют 8-14% послеоперационных раневых нозокомиальных инфекций (НКИ).

E. faecalis отличаемся от Е. faecium мощной продукцией супероксид-аниона. Установлено, что основная часть штаммов Е. faecalis образует супероксид-анион, тогда как среди рода E. faecium такие штаммы встречаются менее часто. Покапано, что штаммы Е. faecalis, выделенные из крови больных, вырабатывают супероксид-анион на 60% больше, чем штаммы, выделенные из фекалий. Пока остается неясным, какую роль играет способность вырабатывать супероксид-анион в патогенезе энтерококковых инфекций. Возможно, штаммы энтерококков, отличающиеся мощной продукцией супероксид-аниона, способны лучше использовать среду своего обитания, лучше физиологически адаптированы к утилизации ограниченных ресурсов кишечника в условиях огромной конкуренции, что ведет к усилению их роста.

Возможность ПЦР-диагностики инфекций мочевыводящих путей, вызванных бактериальными возбудителями.

Инфекции мочевыводящих путей (ИМП) продолжают оставаться одними из самых распространенных бактериальных инфекций человека. Наиболее частыми возбудителями являются Escherichia coli, реже встречаются другие представители семейства Enterobacteriaceae, бактерии родов Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus, Pseudomonas, Acinetobacter. Роль грамположительной флоры увеличивается при развитии хронических заболеваний или госпитальных инфекций. Более чем у 20% больных наблюдается ассоциация микробов, при этом грамотрицательные бактерии чаще сочетаются с грамположительными (например: E. сoli и E. faecalis).

ИМП у женщин встречаются гораздо чаще, чем у мужчин, что обусловлено анатомическим строением мочевыделительной системы. В год в среднем 8–15% взрослых женщин страдают от ИМП, тогда как встречаемость ИМП у мужчин той же возрастной группы примерно 1% в год. Серьезную проблему представляет ОИМП (осложненные инфекции мочевыводящих путей), к которым относятся заболевания, характеризуемые наличием функциональных или анатомических патологий в организме. Пациенты, страдающие ОИМП, более остальных склонны к быстрому развитию инфекционного процесса, который, в свою очередь, требует принятия быстрого решения о назначении адекватной терапии.

Диагноз ИМП ставится на основании клинических симптомов и результатов лабораторной диагностики. В качестве методов диагностики ИМП в клинических лабораториях используют проточные цитометры, микроскопию с окрашиванием по Граму, микробиологические методы исследования мочи. Посев мочи на наличие бактерий остается референсным методом исследования, давая представление о качественном и количественном составе микрофлоры, а также чувствительности выделенного микроорганизма к антибиотикам. Однако, данный метод является достаточно длительным и трудоемким, помимо того существует ряд возбудителей (анаэробная флора, L-формы микроорганизмов), культивирование которых представляет особенную сложность и часто не доступно для клинических лабораторий.

С диагнозом ИМП в микробиологическую лабораторию для рутинной обработки поступает большое количество анализов, требующих разработки и применения быстрых и чувствительных методов обнаружения бактерий в моче. В первую очередь это относится к таким группам пациентов, как беременные, пациенты с бессимптомной бактериурией, дети. Для сокращения времени выдачи результатов актуальной задачей является разработка нового скринингового метода, который позволит быстро выявить отрицательные образцы мочи и даст представление о видовом составе патогенов в исследуемом материале. В этой связи наиболее перспективным выглядит метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), который позволяет быстро и точно проводить идентификацию бактерий путем анализа генетического материала микроорганизмов.

Принцип действия тест-систем по обнаружению основных возбудителей ИМП и бактериурии основан на обнаружении специфичных участков геномной ДНК бактерий с детекцией продуктов ПЦР в режиме реального времени. ПЦР «в реальном времени» характеризуется возможностью проведения качественного и количественного анализа.

Целью данной работы была оценка возможности нового скринингового метода идентификации патогенов в моче путем количественной ПЦР в режиме реального времени и сравнение полученных результатов с микробиологическими методами исследования.

Материалы и методы

Клинические образцы. Клинико-лабораторное исследование для оценки диагностической чувствительности и специфичности тест-системы проведено на 200 клинических образцах мочи в группе 200 пациентов. Из них 154 (77%) женщины и 46 (23%) мужчин. Средний возраст пациентов составил 30 лет (от 0 до 89). В 20 случаях моча поступала от беременных, 125 образцов поступили с отметкой «обследование», и для 55 пациентов был известен предварительный диагноз: ИМП (n = 11), мочекаменная болезнь, МКБ (n = 9), хронический пиелонефрит (n = 5), почечная колика (n = 4), острый пиелонефрит (n = 3), хронический цистит (n = 3), внутрижелудочковое кровоизлияние (n = 3), пиелонефрит (n = 2), гестационный пиелонефрит (n = 2), нейрогенный мочевой пузырь (n = 2), гидронефроз (n = 3), острый цистит (n = 1), хронический цистит/пиелонефрит (n = 1), хроническая болезнь почек (n = 1), цистит (n = 1), гломерулонефрит (n = 1), гипербилирубинемия (n = 1), острый синусит (n = 1), гепатоспленомегалия (n = 1), врожденная пневмония (n = 1), множественные пороки развития (n = 1).

Микробиологические исследования. Образцы мочи поступали в микробиологическую лабораторию для посева на микрофлору. Посев производили на неселективную среду Уриселект 4 (Bio-Rad, США) для изолирования и подсчета микроорганизмов из мочевого тракта; прямой идентификации E. coli (розовые колонии), Enterococcus spp (синие колонии), Proteus mirabilis (коричневые колонии); предварительной идентификации KES-группы (Klebsiella, Enterobacter, Serratia). Также посев производили на 5% кровяной агар для выделения бактерий рода Streptococcus и определения гемолитических свойств микроорганизмов.

Культивировали при 37 °С в течение 24 часов при аэробных условиях. Выросшие бактерии, количество которых на чашке превышало 10*4 КОЕ/мл, считались возбудителями инфекции. При наличии роста проводили идентификацию выросших микроорганизмов методом MALDI ToF масс-спектрометрии с применением анализатора Autoflex III Smartbeam (Bruker Daltonics, Германия)и программного пакета MALDI Biotyper 3.1 (Bruker Daltonics, Германия).

Количественная ПЦР в режиме реального времени. Для определения концентрации микробной ДНК в исследуемом образце использовали плазмидные конструкции с клонированной последовательностью целевого продукта ДНК соответствующего возбудителя, растворенные в ТЕ-буфере (10mM Tris-HCl, pH 8,0; 1mM EDTA). Количество копий (геном-эквивалентов) плазмидной ДНК в стоковом растворе соответствовали концентрации 10*10 копий/мл. Затем путем 10-кратных разведений были приготовлены растворы с концентрацией ДНК 10*8—10*2 копий/мл, которые использовали для построения калибровочных кривых. Постановку ПЦР и интерпретацию полученных данных проводили на приборе iCycler IQ5 (BioRad, США) по следующей программе: 94 °С – 1,5 минуты, затем 40 циклов: 95 °С – 10 секунд (денатурация), 64 °С – 11 секунд (отжиг праймеров), 72 °С – 20 секунд (элонгация). Детекция продуктов прибором осуществляется автоматически в каждом цикле амплификации. На основе этих данных управляющая программа строит кривые накопления флуоресцентного сигнала по каждому из заданных для образцов каналу. Для расчета количества геном-эквивалентов соответствующих микроорганизмов в клинических образцах параллельно проводили реакцию амплификации с калибровочными образцами в концентрации от 10*8 до 10*2 копий/мл гена 16S rRNA.

Перерасчет количества геном-эквивалента в анализируемых образцах проводили с учетом копийности гена 16S rRNA для каждого детектируемого микроорганизма: Enterococcus sp, Streptococcus sp , Pseudomonas aeruginosae – 4 копии гена, Staphylococcus aureus – 5 копий, E. coli, Proteus sp, Serratia sp – 7 копий и Enterobacter sp – 8 копий гена. Все образцы, цикл выхода которых был ниже 35, считались отрицательными. По завершении всех действий программа автоматически рассчитывает точки пересечения кривых накопления флуоресцентного сигнала каждого образца с пороговой линией, строит калибровочную кривую и рассчитывает концентрацию ДНК в исследуемых образцах.

В ходе клинических испытаний были проанализированы 200 образцов мочи. Все образцы после проведения микробиологических исследований поступали в лабораторию ПЦР для выделения ДНК и тестирования на наличие ДНК возбудителей методом количественной ПЦР в режиме реального времени с применением набора «Септоскрин».

Согласно результатам микробиологических посевов в 95 образцах мочи (95/200, 47,5%) роста микроорганизмов не наблюдалось, в 70 образцах (70/200, 35%) обнаружен один бактериальный возбудитель. В 35 образцах мочи (35/200, 17,5%) выявлены полимикробные инфекции, из них в 7 образцах (7/35, 20%) обнаружено более двух патогенов. В случаях мономикробной инфекции наиболее часто выявлялись Escherichia coli (27/70, 38,6%), Enterococcus faecalis (20/70, 28,6%) и Enterococcus faecium (8/70, 11,4%). В 4,3% (3/70) единственным выявленным возбудителем были коагулазонегативные стафилококки, в 2,9% (2/70) — Streptococcus spp. Бактерии KES-группы (Klebsiella, Enterobacter, Serratia) в моноинфицированных образцах обнаруживались в 10% случаев (7/70). В оставшихся образцах 4,3% выделенных возбудителей пришлось на долю Candida spp (2/70, 2,9%) и Pseudomonas mosselii (1/70, 1,4%). Среди образцов с полимикробными инфекциями в случаях выявления двух возбудителей доминировало сочетание E. сoli и E. faecalis (11/35, 31,4%). В 6 случаях обнаруживались сочетания бактерий E. coli/K. pneumonia (4/35, 11,4%), и E . faecаlis /Streptococcus spp. (2/35, 5,7%). При выявлении трех и более возбудителей сочетание E. coli / E. faecalis /Staphylococcus spp. было наиболее часто встречаемым (3/7, 42,9%).

Результаты ПЦР. Методом количественной ПЦР в режиме реального времени в 123 образцах (123/200, 61,5%) возбудителей не обнаружено. Из 77 положительных образцов (77/200, 38,5%) один бактериальный возбудитель выявлен в 48 образцах мочи (48/77, 62,3%), два возбудителя — в 16 образцах (16/77, 20,8%), три и более — в 13 образцах (13/77, 16,9%). Среди мономикробных образцов мочи согласно результатам ПЦР бактерии E. coli детектированы в 28 образцах (28/48, 58,3%), в 10 образцах (10/48, 21,8%) обнаружены бактерии рода Enterococcus, в 8 — бактерии группы KES (8/48, 16,7%), в 1 — Staphylococcus aureus (1/48, 2,1%), в 1 – Pseudomonas aeruginosa (1/48, 2,1%). При полимикробных инфекциях методом ПЦР сочетания E. coli и бактерий рода Enterococcus выявлены в 6 образцах (6/16, 37,5%). Сочетания E. coli и бактерий родов Enterobacter/Klebsiella, а также Enterobacter spp/Klebsiella spp и Enterococcus spp обнаруживались с одинаковой частотой – 3/16, 18,75%. При выявлении трех возбудителей одновременно доминирующим сочетанием было E. coli/Enterococcus spp/(Enterobacter spp/Klebsiella spp) – 7/13, 53,8%.

Обсуждение результатов

В последнее время появляется все больше информации об успешном применении метода ПЦР в качестве быстрой диагностики заболеваний, причиной которых являются бактериальные возбудители. В представленном исследовании рассмотрена возможность применения количественной ПЦР в режиме реального времени для быстрого обнаружения патогенов в моче пациентов с ИМП и бактериурией. Сравнение нового скринингового и традиционного культурального методов исследования мочи показало как сравнительное преимущество, так и ограничения в применимости обоих методов.

Основным недостатком стандартного бактериологического метода диагностики является длительность его исполнения, иногда превышающая 48 часов. В связи с долгосрочностью анализов зачастую пациентам назначается эмпирическая, часто неадекватная антибактериальная терапия либо до получения результатов идентификации патогена в моче, либо вообще без проведения каких-либо процедур, направленных на выявление возбудителя, а также установления его лекарственной чувствительности. Подобная терапия может увеличивать риск развития осложнений. Например, проведенные ранее исследования доказали, что каждый час задержки адекватной противобактериальной терапии пациентов с септическим шоком снижает уровень выживаемости на 8 %. Особенно критично данное положение у пациентов пожилого возраста, детей и лиц с иммунодефицитом.

В сравнении с культуральным методом получение результатов идентификации патогенов методом ПЦР занимает 4–5 часов, что может способствовать раннему назначению этиотропного лечения.

Важным критерием для постановки правильного диагноза является точность идентификации и подсчет количества микроорганизмов в клиническом материале. При подозрении на ИМП и бактериурию нередко в моче обнаруживается полиинфекция. Культуральный метод с применением селективных сред при полимикробной инфекции не лишен погрешностей в связи с невозможностью подбора оптимальных условий культивирования всех возбудителей инфекции, а проведение дополнительных биохимических тестов для определения видовой принадлежности бактерии является процессом трудоемким, дорогостоящим и долговременным.

Преимуществами метода ПЦР, позволяющего выявлять генетические маркеры любых микроорганизмов, является высокая чувствительность и специфичность. В наших исследованиях мы столкнулись с погрешностью идентификации патогенов культуральным методом. В 4-х случаях (4/200, 2,0%) идентификация выявленного возбудителя была проведена некорректно. В 3 мономикробных и 1 полимикробном образцах мочи культуральным методом идентифицированы патогены рода Enterococcus, однако с помощью системы «Энкопол» (Enterococcus faecalis/E. faecium) из набора «Септоскрин» идентифицировать данные микроорганизмы в образцах не удалось. Дополнительная идентификация выросшей мономикробной культуры методом масс-спектрометрии на приборе Autoflex III Smartbeam подтвердила принадлежность данных микроорганизмов к бактериям вида Aerococcus viridans и Lactobacillus crispatus. В одном мономикробном образце по результатам ПЦР тестирования набором «Колипол» была идентифицирована E. coli в количестве 5*103 геном-эквивалентов/мл. В 1 полими-кробном образце мочи согласно результатам ПЦР система «Энтеропол» (Enterobacter spp/Klebsiella spp) указала на присутствие в образце бактерий семейства

Enterobacteriaceae. При дальнейшем исследовании культура была идентифицирована как Escherichia coli в первом случае и Klebsiella pneumoniae во втором методом масс-спектрометрии.

Количество идентифицированных E. coli в качестве единственного возбудителя, возросло незначительно (с 27 до 29), значительно увеличилось число случаев (с 28 до 36) выявления E. coli методом ПЦР в количестве 10*3геном-эквивалентов/мл и более. Такие же результаты получены при сопоставлении результатов идентификаций бактерий рода Enterococcus. В моноинфицированных пробах при снижении клинически значимого порога до 10*3 КОЕ/мл количество детектированных Enterococcus spp увеличилось с 29 до 33, тогда как с помощью ПЦР «в реальном времени» энтерококки удалось обнаружить в 16 образцах при снижении порога до 10*3 геном-эквивалентов. Остальные выделенные патогены при снижении порога обнаруживались с одинаковой частотой.

Более значимые изменения в результатах наблюдались при исследовании полимикробных образцов с учетом снижения порога до 10*3. Частота обнаружения ДНК E. coli в смешанных образцах возросла с 21 до 29, тогда как результаты микробиологических посевов мочи не изменились. Значительно увеличилось количество детектированных бактерий рода Enterococcus (с 22 до 34 методом ПЦР), Enterobacter spp и Klebsiella spp (с 16 до 25 методом ПЦР) в полимикробных пробах. Также почти в 2 раза возросла частота обнаружения бактерий рода Serratia (с 3 до 7).

Таким образом, при использованием диагностических тест-наборов «Септоскрин» с учетом снижения порога клинической значимости выделенных патогенов до 10*3 геном-эквивалентов/мл частота выявления грамотрицательных патогенов в моче увеличилась на 25%, а грамположительной — на 36,8%.

В 29 образцах при отсутствии роста микроорганизмов на питательных средах методом ПЦР-диагностики дополнительно было выявлено 42 патогена в количестве 10*3 – 10*4 геном-эквивалентов/мл. Из них 13 были мономикробные образцы и 16 — полимикробные. Среди моноинфицированных проб чаще всего выявляли представителей семейства Enterobacteriaceae (3 E. coli, 6 бактерий KES-группы), энтерококки детектировали в 3 случаях, стрептококки — в 2 случаях, P. aeruginosa – 1, и S. aureus – 1. При анализе 16 полимикробных образцов мочи дополнительно методом ПЦР выявлены бактерии семейства Enterobacteriaceae (E. coli – в 4 случаях, бактерии группы KES – в 9), Enterococcus spp – в 6 случаях, P. aeruginosa — в 3, S. aureus – в 2, Proteus spp — в 1 и стрептококки – в 1. Согласно данным, представленным в ASM

Опираясь на количественные данные, мы сопоставили количество КОЕ/мл, полученные при культуральном методе идентификации, и количество геном-эквивалентов/мл каждого микроорганизма, полученных при пересчете данных после ПЦР. В 11 случаях количество геном-эквивалентов E. coli в мл превышало количество КОЕ, выросших на чашках, на 1,5–2 порядка, других патогенов семейства Enterobacteriaceae — в 9 пробах, энтерококки — в 8 образцах мочи, Proteus spp — в 2, S. aureus и P. aeruginosa – в 1. Мы полагаем, что подобные результаты могут быть получены вследствие начала приема антибактериальных препаратов, назначенных до сдачи мочи на анализ и получения результатов выделения патогенов в моче. При наличии инфекции прием антибактериальных препаратов приводит к уменьшению количества заселяющих мочевыводящий тракт микроорганизмов, вследствие чего титр жизнеспособных клеток в моче при микробиологическом посеве будет ниже. Так как при выделении ДНК все бактериальные клетки подвергаются лизису, количество геном-эквивалентов рассчитывается, исходя из тотального количества ДНК в пробе, что не отражает жизнеспособности бактерий. Принимая во внимание, что моча является достаточно агрессивной средой, не пригодной для нормальной жизнедеятельности микроорганизмов, количество мертвых клеток в моче могло увеличится также вследствие несоблюдения правил хранения и транспортировки проб мочи с момента взятия материала до момента проведения анализа. Полагая, что бактерии могли погибнуть в моче вследствие длительной транспортировки или при неправильном хранении пробы, можно ожидать, что первоначальный титр жизнеспособных клеток в моче был выше, что дает основания рассматривать результаты ПЦР как истинные, а результаты посевов как ложноотрицательные или заниженные. Особенно актуальным остается этот вопрос при выявлении грамотрицательной флоры. В 12 образцах при наличии роста микроорганизмов на питательных средах методом ПЦР искомых патогенов обнаружено не было. В 8 случаях преобладала грамположительная флора: в 1 полимикробной пробе мочи, поступившей от беременной, были детектированы 2 патогена в количестве 10*4 КОЕ/ мл: E. faecalis и Streptococcus agalactiae, у 6 пациентов обнаружен энтерококк в титре от 10*4 до 10*5, в 2 пробах детектированы S. agalactiae 10*5 КОЕ/ мл.

Среди оставшихся 4 образцов мочи в 2 пробах зафиксирован рост E. coli и в 2 — представители семейства Enterobacteriaceae. В обоих случаях обнаружения E. coli образцы мочи поступили от женщин 1933 и 1991 года рождения, бактерии выявлены в титрах 10*5 и 10*4 соответственно. Высокий титр дает основание предполагать наличие инфекции в обоих случаях. Из 2 оставшихся проб мочи с выделенными бактериями рода Enterobacter, первый образец получен с пометкой «обследование» от мужчины 65 лет, титр возбудителя составил 10*4 КОЕ/мл. Вторая проба поступила от новорожденного также с пометкой «обследование», титр составил 10*7 КОЕ/мл. При обнаружении в моче новорожденного бактерий в количестве, превышающем 10*4 КОЕ/мл, наиболее вероятно наличие воспалительного процесса. Обнаружение в моче мужчины представителей рода Enterobacter в титре 10*4 и выше указывает на инфекцию мочевыводящих путей. Несмотря на отрицательные результаты ПЦР-тестов и, основываясь на свидетельствах об инфекции согласно полученным положительным результатам микробиологических посевов, данная проблема получения ложноотрицательных результатов ПЦР остается актуальной.

Наиболее важным вопросом при принятии решения о назначении адекватного лечения остается лекарственная чувствительность выделенных бактериальных возбудителей, которая на сегодняшний день может быть определены лишь микробиологическими методами исследования. Методом ПЦР возможно определение только генетически обусловленной устойчивости патогена. Вариантами такой устойчивости среди грамотрицательных микроорганизмов является устойчивость к β-лактамным антибиотикам (гены TEM, SHV, CTX-M, OXA, VIM, NDM) и фторхинолонам (гены GyrA, ParC, QnrA), среди грамположительных микроорганизмов — устойчивость Enterococcus spp к гликопептидам (гены VanA, VanB), устойчивость стафилококков к β-лактамным антибиотикам (ген MecA), устойчивость стрептококков к макролидам (гены Mef и Erm) и фторхинолонам. Из-за долгосрочности выполнения посевов для определения антибиотикоустойчивости выделенных патогенов, наборы для определения чувствительности бактерий методом ПЦР в режиме реального времени представляют собой хорошее дополнение к имеющейся панели реактивов. Разработка и тестирование серии ПЦР-наборов для обнаружения детерминант резистентности является темой для дальнейших исследований. Несмотря на высокую специфичность и чувствительность систем и значительное сокращение времени проведения анализа, очень важным ограничением остается то, что не все патогены, встречаемые в моче, можно детектировать методом ПЦР. Такие возбудители, как Candida sp, Acinetobacter spp, коагулазонегативные стафилококки, Citrobacter spp, Stenotrophomonas maltophilia, Morganella morganii и др., обнаруженные в моче культуральным методом, пропущены при исследовании мочи методом ПЦР «в реальном времени». Подобное ограничение возможно устранить путем создания новых тест-систем.

Принцип действия тест-систем по обнаружению основных возбудителей ИМП и бактериурии основан на обнаружении специфичных участков геномной ДНК бактерий с детекцией продуктов ПЦР в режиме реального времени. ПЦР «в реальном времени» характеризуется возможностью проведения качественного и количественного анализа.

Энтерококки (лат. Enterococcus) – это род шарообразных или слегка вытянутых, грамположительных бактерий семейства Энтерококковые (Enterococcaceae). Размещение обычно происходит парами (диплококки) или же короткими цепочками.

По физиологическим характеристикам энтерококки очень схожи со стрептококками, в связи с чем, изначально, до 1984 года, этот вид бактерий относили к стрептококковой инфекции.

По состоянию на 2021 год, к энтерококкам причислено 15 видов бактерий, наиболее популярными из которых являются – энтерококк фекальный (Enterococcus faecalis) и энтерококк фэциум (Enterococcus faecium), которые также выступают в качестве симбиотических микроорганизмов кишечника человека.

Энтерококки являются условно-патогенными бактериями, т.е. для нанесения вреда организму необходимо сочетание нескольких условий, например – повышенное количество энтерококков на фоне ослабленной иммунной системы.

Характеристика энтерококков

Энтерококки представляют собой круглые или слегка овальные, грамположительные, факультативные анаэробы, размером 0,6–2,0 на 0,6–2,5 мкм, для размножения и жизнедеятельности которых достаточно как большое, так и малое количество кислорода. Рост и развитие этого вида бактерий происходит за счет энергии брожения, при температуре 10-45 °С. Наиболее же оптимальной температурой окружающей среды для наилучшего размножения инфекции является 35-37 °С.

Основным ареалом обитания и размножения энтерококков является тонкая кишка. В меньших количествах их можно обнаружить в толстой кишке, половых органах, губчатой части мочеиспускательного канала, а в некоторых случаях и в ротовой полости.

Внутри организма энтерококки выполняют роль метаболизма по бродильному типу, ферментируя углеводы в молочную кислоту и другие вещества. Кроме того, они обладают свойством понижать в органах пищеварения кислотность – до 4,2–4,6, а также, находясь на слизистых оболочках, энтерококки обеспечивают им своего рода защитную функцию (колонизационная резистентность слизистой оболочки) от другой патогенной микрофлоры, сохраняя целостность слизистой.

Этот род бактерий считается довольно устойчивым к различным неблагоприятным факторам. Они спокойно выживают при нагревании до 60 °С в течение 30 минут, обработке многими дезинфицирующим средствами, или же просто, располагаясь вне организма на предметах личного обихода человека.

Норма энтерококков в организме

Нормальным показателем количества энтерококков в организме человека является (в 1 грамме фекалий):

• у маленьких детей — 106-107;
• у взрослых людей – 107-108;
• у лиц пожилого возраста — 106-107.

Если сравнивать количество энтерококков с бифидобактериями в организме, то соотношение будет составлять примерно 1:100. В целом, в организме находится не более 1% энтерококков от всевозможных бактерий, живущих в человеке.

Из них, 80-90 % — энтерококк фекальный (Enterococcus faecalis), 5-10 % энтерококк фэциум (Enterococcus faecium), а также следы Enterococcus gilvus, Enterococcus pallens.

Причины энтерококка

Как передается энтерококк? Для присутствия данного вида бактерий, человеку в большинстве случаев ненужно предпринимать каких-либо действий, т.к. энтерококки являются обитателями нормальной микрофлоры человека. Другое дело, что их количество внутри органов желудочно-кишечного тракта не превышает 1% от остальных микроорганизмов.

Заражение энтерококком осуществляется:

• При кормлении младенца грудью;
• При ранениях, порезах;
• Употреблении инфицированных и немытых продуктов питания;
• Употребление пищи немытыми руками, или же контакт грязных рук с губами или слизистой рта;
• Несоблюдение правил личной гигиены, в том числе по уходу за половыми органами.
• Проблемы со здоровьем начинаются на фоне следующих факторов:
• Нарушение в организме обменных процессов;
• Нарушения баланса микрофлоры (лакто- и бифидобактерий, которые регулируют количество энтерококков в органах пищеварения) в кишечнике, чему способствует прием антибактериальных препаратов;
• Гормональный дисбаланс;
• Снижение реактивности иммунитета, чему способствуют: переохлаждение организма, стрессы, наличие различных заболеваний (особенно инфекционного характера — ОРВИ, грипп, ОРЗ, ВИЧ-инфекция, туберкулез, сахарный диабет и другие);
• Неполноценное питание, с ограниченным количеством витаминов и микроэлементов (минералов).

Иногда неблагоприятным фактором, способствующим развитию энтерококковых заболеваний является естественное старение человека, злоупотребление алкоголем.

Виды энтерококка

Наиболее патогенными видами являются — Enterococcus faecalis (фекальный энтерококк), Enterococcus faecium (энтерококк фэциум), Enterococcus durans.

В целом, по состоянию на 2021 год открыты следующие виды энтерококков: E. alcedinis, E. aquimarinus, E. asini, E. avium, E. azikeevi, E. bulliens, E. caccae, E. camelliae, E. canintestini, E. canis, E. casseliflavus, E. cecorum, E. columbae, E. crotali, E. devriesei, E. diestrammenae, E. dispar, E. durans, E. eurekensis, E. faecalis, E. faecium, E. gallinarum, E. gilvus, E. haemoperoxidus, E. hawaiiensis, E. hermanniensis, E. hirae, E. inusitatus, E. italicus, E. lactis, E. lemanii, E. malodoratus, E. massiliensis, E. moraviensis, E. mundtii, E. olivae, E. pallens, E. pernyi, E. phoeniculicola, E. plantarum, E. pseudoavium, E. quebecensis, E. raffinosus, E. ratti, E. rattus, E. rivorum, E. rotai, E. saccharolyticus, E. saigonensis, E. silesiacus, E. sulfureus, E. termitis, E. thailandicus, E. ureasiticus, E. ureilyticus, E. viikkiensis, E. villorum, E. xiangfangensis, E. xinjiangensis.

Лечение энтерококка народными средствами

Важно! Перед применением народных средств проконсультируйтесь с врачом.

Уменьшению популяции энтерококков в организме способствует употребление таких даров природы, как – курага, малина, земляника, черника, черная смородина, барбарис.

Настои из таких растений как – ромашка аптечная и рябина черноплодная обладают антимикробным действием, уничтожая инфекцию в организме. Для их приготовления необходимо 1-2 ч. ложки сырья залить стаканом кипятка, дать настояться в течение 30 минут, процедить и выпить за 30 минут до приема пищи, 2 раза в день.

Другие народные средства:

Петрушка – обладает хорошим противомикробным и мочегонный действием. Для приготовления этого народного средства от энтерококков нужно 1 ст. ложку тщательно измельченных листьев петрушки залить 500 мл холодной воды, после отставить на ночь для настаивания. Пить средство необходимо по несколько глотков в течение всего дня.

Василек. 1 ст. ложки измельченных листьев василька залейте стаканом кипятка, после дайте средству настояться в течение часа, процедите его. Принимать настой нужно по 2 ст. ложки, 3 раза в день, за 30 минут до еды.

Грыжник голый. 1 ч. ложку растения необходимо залить стаканом кипятка, дать настояться около 30 минут, после процедить. Выпить настой нужно за 2 раза, по 100 мл, утром и вечером, до еды.

Зеленчук желтый – обладает антимикробным и регулирующим популяцию бактерий в организме действием. Для приготовления средства необходимо 1 ст. ложку травы залить стаканом кипятка, после дать ему настояться около 30 минут, процедить. Выпить приготовленный настой нужно весь стакан целиком за один раз, за 30 минут до еды, и так 3 раза в день.

Важно! Перед применением антибиотиков обязательно проконсультируйтесь с лечащим врачом.
Перед рассмотрением антибиотиков при энтерококковых болезнях, рассмотрим их взаимодействие (резистентность) с данным видом инфекции.

Энтерококки — повсеместно распространенные грамположительные бактерии, активно живущие в окружающей среде и теле человека. Они относятся к группе стрептококковых микробов, обитающих в кишечнике теплокровных. Род Enterococcus включает бактерии, необходимые человека для нормальной жизнедеятельности, здорового пищеварения и функционирования всего организма, а также микробы, которые являются потенциально опасными и при определенных обстоятельствах могут вызывать различные патологии. Чтобы они проявили свои патогенные качества, необходимы благоприятные условия – снижение иммунной защиты.

Бактерии заселяют слизистую оболочку тонкого и толстого кишечника, уретры, половых органов. Процесс колонизации начинается с момента появления ребенка на свет. Более активно он протекает у детей, находящихся на естественном вскармливании. Основные представители данного рода – Enterococcus faecalis и Enterococcus faecium. Эти виды в определенном количестве входят в состав нормальной микрофлоры человека и оказывают положительное влияние на процессы жизнедеятельности. Под воздействием негативных эндогенных или экзогенных факторов бактерии начинают активно размножаться. Когда их количество значительно возрастает, возникает дисбактериоз или развивается патологический процесс.

Enterococcus spp. являются возбудителями заболеваний органов мочевыделительной системы, раневых и внутрибольничных инфекций, патологических процессов в брюшной полости. Они вызывают эндокардиты, холециститы, панкреатиты, циститы, уретриты, пищевые токсикоинфекции.

Энтерококки относятся к санитарно-показательным микроорганизмам — используются для оценки санитарного состояния сточных вод, почвы, продуктов питания. Эти бактерии являются высокочувствительными показателями свежего фекального загрязнения воды и водных объектов, поскольку они не размножаются вне организма теплокровных.

Энтерококки имеют схожие физиологические свойства со стрептококками. Благодаря этому их изначально относили к роду стрептококков. В настоящее время их выделяют в отдельный род Enterococcus.

Эпидемиология

Заражение младенцев происходит в роддоме в первые минуты жизни, когда их прикладывают к груди матери. Заселение кишечника энтерококками у детей, находящихся на искусственном вскармливании, происходит намного сложнее и дольше. Они получают микробов с окружающих предметов, воздуха и рук персонала.

В организме распространение инфекции происходит из ЖКТ в другие локусы и органы. Заражение энтерококком от других людей встречается крайне редко.

Enterococcus faecalis обнаруживается у больных в 90% случаев , а Enterococcus faecium — в 10%. Количество всех остальных видов энтерококков в кале человека настолько мало, что не представляет никакого интереса для микробиологов и не имеет никакой практической значимости для медицины в целом. Иные виды энтерококков являются заносными и непатогенными, не опасными в плане здоровья.

Пути проникновения энтерококков в организм человека:

• Грудное вскармливание,
• Нарушение целостности кожного покрова — раны, порезы,
• Употребление обсемененных продуктов,
• Грязные руки, недостаточный уход за половыми органами.

Факторы, провоцирующие развитие энтерококковой инфекции:

• Дисбактериоз на фоне приема антибиотиков,
• Гормональный сбой,
• Иммунодефицит,
• Эмоциональное перенапряжение,
• Вирусная инфекция,
• Тяжелые хронические недуги – сахарный диабет,
• Нерациональное питание,
• Гиповитаминоз,
• Пожилой возраст,
• Алкоголизм,
• Гормонотерапия, лечение цитостатиками,
• Иммуносупрессия после пересадки органов,
• Облучение,
• Длительное нахождение человека в небольших замкнутых пространствах или экстремальных условиях,
• Инвазивные инструментальные исследования,
• Младенческий возраст,
• Гипоксия в родах,
• Недоношенность, внутриутробное инфицирование, врожденная патология ЖКТ.

Энтерококки, размножаясь и достигая значительного количества в организме человека, способны вызвать следующие заболевания:

• Воспаление органов мочевыделительной системы — цистит, уретрит;
• Воспаление различных отделов кишечника — дивертикулит, энтерит, перитонит, аппендицит, парапроктит;
• Воспаление мозговых оболочек — менингит;
• Эндокардит, бактериемия, сепсис.

Диагностика

Основным диагностическим методом энтерококковой инфекции является микробиологический. В лаборатории проводят исследование отделяемого влагалища на микрофлору, анализ кала на дисбактериоз, бакпосев мочи.

Микробиологическое исследование отделяемого влагалища проходит в несколько этапов. Сначала отбирают биоматериал. Делают это гинекологи в стационаре или поликлинике стерильным ватным тампоном. В течение 2 часов пробирки доставляют в баклабораторию, где непосредственно переходят к исследованию. Засевают материал на твердые питательные дифференциально-диагностические среды — кровяной агар, энтерококкагар и другие, а также в сахарный бульон для подращивания. На следующий день изучают характер роста. В сахарном бульоне энтерококки дают интенсивный рост в виде диффузного помутнения среды. Энтерококки, способные вызвать патологический процесс растут на кровяном агаре с выраженной зоной гемолиза. Колонии микроскопируют. Для подтверждения принадлежности культуры к роду энтерококков петлей делают посев в молоко с метиленовой синькой и на желточно-солевой агар. Метиленовую синь они редуцируют, изменяя цвет на кремовый.

Энтерококкагар — это селективная среда, на которой фекальный энтерококк растет в виде красно-коричневых колоний без ободка, а E.faecium — со светлым ободком вокруг каждой колонии. На этой среде производят подсчет колоний каждого типа и определяют степень роста энтерококков во влагалище. Если имеется рост только в жидкой среде, это первая степень роста — очень скудный рост; рост единичных колоний на плотной среде — вторая степень, скудный рост; от 10 до 100 колоний на среде — 3 степень, умеренный рост; более 100 колоний — обильный рост, 4 степень. Первая и вторая степень роста не свидетельствует в пользу воспалительного процесса, вызванного энтерококками. При 3 и 4 степень роста больным требуется лечение.

Бакпосев мочи первоначально осуществляется на кровяной агар, мясо-пептонный агар и сахарный бульон. После выявления подозрительных колоний на кровяном агаре, их изучают по той же схеме — микроскопия, дополнительные тесты, подсчет колоний.

Анализ кала на дисбактериоз проводится не ранее, чем через 7-10 дней после прекращения антибиотикотерапии. За три дня до обследования назначается общий стол. Фекалии забирают при помощи стеклянной стерильной палочки из глубины исследуемого материала, после естественной дефекации в стерильную посуду, у новорожденных — с пеленки. Материал исследуют не позднее 2 часов от момента забора. При получении материала в лаборатории производят повторное взвешивание пробы и определяют ее истинный вес. В зависимости от веса пробы добавляют физраствор, чтобы получилось разведение 1:10, тщательно эмульгируют и засевают в накопительные и селективные питательные среды. Энтерококки растут на молочно-ингибиторной среде и энтерококкагаре. На этих средах подсчитывают количество выросших колоний, изучают их морфологию и устанавливают видовую принадлежность. После проведения окончательной идентификации результаты оценивают по специально разработанным формулам, сравнивают их с нормативными показателями и делают выводы о том, какая степень дисбиоза у данного больного.

Профилактика

Профилактические мероприятия направлены на укрепление иммунитета, правильное питание, отказ от вредных привычек, ведение активного образа жизни, занятия спортом, закаливание.

• Соблюдать правила личной гигиены – мыть с мылом руки перед едой и после посещения общественных мест.
• Употреблять в пищу полезные продукты.
• Избегать конфликтных ситуаций и эмоционально не напрягаться.
• Защищать организм от переохлаждения.
• Соблюдать режим труда и отдыха.
• Высыпаться.
• Не принимать бесконтрольно антибиотики и любые другие препараты.
• Увеличить двигательную активность.
• Своевременно лечить имеющиеся хронические болезни.

Заражение младенцев происходит в роддоме в первые минуты жизни, когда их прикладывают к груди матери. Заселение кишечника энтерококками у детей, находящихся на искусственном вскармливании, происходит намного сложнее и дольше. Они получают микробов с окружающих предметов, воздуха и рук персонала.

Давайте будем совместно делать уникальный материал еще лучше, и после его прочтения, просим Вас сделать репост в удобную для Вас соц. сеть.